Laporan Kimia Analisis Instumen HPLC

I.PENDAHULUAN

A. Judul
         HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

B. Tujuan
1. Mengetahui prinsip metode pemisahan senyawa dengan HPLC
2. Menghitung konsentrasi suatu senyawa dalam sampel dengan menggunakan metode regresi                linear

II. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Berdasrkan percobaan yang telah dilakukan diperoleh hasil sebagai berikut:

Gambar alat, komponen dan fungsi HPLC

1 Monitor : Menampilkan hasil analisis sampel oleh detektor
2 Detektor : Mendeteksi dan menganalisis larutan sampel dan sangat sensitif
3 Kolom Injektor : Sebagai tempat injeksi sampel ke dalam alat HPLC dan terdapat fase                          diam didalamnya
4 Pompa 2 : Memompa fase gerak berupa akuabides
5 Lubang Injeksi : Sebagai tempat injeksi sampel menuju kolom injektor
6 Pompa 1 : Sebagai campuran fase gerak
  7 Infus : Meneruskan air dan metanol ke HPLC
8 Air Infus : Sebagai pelarut fase normal
9 Metanol : Sebagai pelarut fase terbalik
       10 Layar Monitor Komputer : Sebagai recorder untuk menyimpan atau merekam data dan                        menampilkan hasil analisis detektor dalam bentuk kromatogram

 


Hasil Pengukuran Larutan Standar
Konsentrasi ( x )   Luas Puncak (y)      x²                xy
50 ppm                       2478966           2500         123948300
100 ppm                       4229531          10000          422953100
150 ppm                       6142679            22500          921401850
200 ppm                      12262609          40000         2452521800
250 ppm                       9025660          62500         5641037511
∑ = 750                    ∑ = 34139445   ∑ = 137500      ∑= 9561862627

Hasil pengukuran larutan cuplikan 
Senyawa                 Luas Puncak Waktu Retensi Konsentrasi
Cuplikan A            4003038        2.480        106,3353377


B. Pembahasan

       HPLC (High Performance Liquid Chromatography)a atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) , HPLC adalah metode analisis yang populer karena mudah untuk dipelajari dan digunakan dan tidak dibatasi oleh volatilitas atau stabilitas senyawa sampel. sejarah bagian HPLC menggambarkan evolusi dari tahun 1970 ke tahun 1990-an. HPLC modern memiliki banyak aplikasi termasuk pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan kuantifikasi dari berbagai senyawa (Nurhamida, 2005).
      Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya (Hendayana, 2006).
      Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-komponen yang ada (Hendayana, 2006).
      Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram (Nurhamida, 2005).
      Keunggulan menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer (Day dan Underwood, 2002).
      Menurut Cserhati dan Forgacs ( 1999 ), Terdapat 5 komponen dasar HPLC yaitu:
1. Reservoir pelarut
      Zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah tempat pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada didalam pelarut.
2. Pompa
      Pompa diperlukan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobil dengan kecepatan dan tekanan tetap. Gangguan pada pompa dapat disebabkan oleh perawatan yang kurang teratur.
3. Injektor
        Pada sampel diinjeksikan dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak menggangu masuknya keseluruhan sampel kedalam kolom. Injeksi dapat menggunakan syringe.
4. Kolom kromatografi
       Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30 mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan berlangsung.
5. Detektor
       Detektor ini berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektor-detektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya adalah detektor spektroskopi (adsorpsi sinar UV), detektor elektrokimia. Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponen-komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.

         Menurut Settle (1997), berdasarkan kepolaran fasa geraknya HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu, sebagai berikut :
a. Fase Normal HPLC
       HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.
b. Fase Balik HPLC
      Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

          Pada percobaan kali ini, yang akan dilakukan adalah penentuan kadar parasetamol dalam sampel dengan metode HPLC. Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti air atau methanol (Hendayana, 1994).
          Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesik dan antipiretik yang populer dan digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam. Digunakan dalam sebagian besar resep obat analgesik salesma dan flu. Paracetamol aman dalam dosis standar, tetapi karena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak sengaja sering terjadi. Paracetamol atau Asetaminofen atau N-Acetyl-para-aminophenol memiliki berat molekul 151,17 g/mol, rumus empiris C8H9NO2, titik leleh 169°C-170,5°C, larut dalam etanol, metanol dan etil asetat, larut dalam air dingin, bersifat polar karena adanya cincin benzen, nitrogen, amida, dan gugus OH (Wahyono dan Hakim, 2009).
          Fasa gerak atau pelarut yang digunakan mengandung beberapa kombinasi yang saling melarutkan seperti air dan pelarut organik (metanol dan asetonitril). Penggunaan air atau metanol, komponen yang lebih hidrofobik akan mengelusi saat fasa gerak yang mengandung lebih banyak metanol. Senyawa yang lebih hidrofobik akan terelusi berdasar kondisi relatif metanol atau air tinggi (Snyder dkk, 1997).
         Metanol merupakan bentuk alkohol paling sederhana. Pada keadaan atmosfer, metanol berbentuk cairan yang ringan, mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang khas (berbau lebih ringan dari pada etanol). Metanol digunakan sebagai bahan pendingin anti beku, pelarut, bahan bakar dan sebagai bahan additif bagi etanol industri. Metanol merupa alkohol yang agresif sehingga dapat berakibat fatal apabila diminum, dan memerlukan kewaspadaan yang tinggi dalam penanganannya. Infused water (Air Infus) berfungsi sebagai pelarut pada fase normal (Snyder dkk, 1997).
         Pada percobaan penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) ini menggunakan fasa gerak metanol dan air dengan komposisi 40:60. Fasa gerak dalam HPLC ini selain berfungsi sebagai pelarut, juga bersifat interaktif sehingga bisa berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Fasa gerak dalam hal ini bertindak sebagai pelarut sangat mempengaruhi waktu retensi, sehingga pelarut yang digunakan harus benar-benar jernih dan murni. Oleh sebab itu, metanol dan air terlebih dahulu disaring.
         Cuplikan dimasukkan kedalam aliran fasa gerak. Gerakan analit bergantung pada interaksi dengan fasa diam saat analit/cuplikan melewati kolom. Banyaknya analit yang mengalir dalam kolom bergantung pada sifat analit itu sendiri dan komposisi dari fasa gerak dan fasa diam. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran yang disebabkan perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu.
         Waktu retensi merupakan waktu khusus untuk analit mengelusi atau keluar dari ujung kolom. Waktu retensi memberikan keterangan yang khas untuk mengidentifikasi karakteristik yang diberikan oleh cuplikan. Untuk mempersingkat waktu difusi komponen didalam kolom, maka ukuran partikel haruslah kecil (membuat tekanan lebih tinggi) sehingga meningkatkan laju linear dan meningkatkan penyelesaian hasil kromatogram.
        HPLC adalah salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat tertentu. Cairan yang akan dipisah merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam ( stasioner ) ( Snyder dkk, 1997 ).
        Prinsip kerja HPLC adalah  ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksi kedalam kolom maka sampel tersebut akan terelusi bersama fase geraknya. Sampel yang dimasukkan kedalam kolom tersebut kemudian akan terurai dan akan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detektor pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal komputer ( PC ) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
        Dari percobaan yang dilakukan digunakan beberapa bahan dan alat yaitu kertas saring yang berfungsi untuk memisahkan endapan paracetamol dengan menggunakan larutan metanol. Harus disaring agar benar-benar hanya paracetamol yang terambil bukan tepungnya. Disaring kedua kali menggunakan kertas saring milipore agar tepung atau analit lain yang masih ada pada sampel paracetamol benar-benar terpisah.
        Fungsi metanol sebagai pembawa komponen-komponen campuran menuju kedetektor dan mampu dalam berinteraksi dengan solute. Fungsi paracetamol adalah sebagai sampel yang digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu senyawa yang ada didalamnya.
        Cara kerja HPLC adalah dengan memanaskan alat HPLC terlebih dahulu selama ± 30 menit. Cara kerja HPLC telah diaplikasikan dalam bentuk software sehingga dapat dianalisis menggunakan komputer. Pertama-tama klik file pada aplikasi dilanjutkan dengan klik data, kemudian klik file yang akan dilihat dan dilanjutkan dengan mengklik mean peak. Selanjutnya, sampel yang telah disiapkan diinjeksi kedalam kolom injektor melalu lubang injeksi. Setelah sampel masuk kedalam injektor, sampel akan dideteksi oleh detektor dengan mengklik pilihan analise now dan sampel akan mulai dianalisis. Klik report dilanjuti dengan mengklik view dan area untuk melihat hasil analisis sampel dalam bentuk kromatogram.
         Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi komponen-komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase diam. Fase gerak yang digunakan berupa campuran metanol dan air dengan perbandingan 40:60. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah kolom C-18 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.
       Pada percobaan ini menggunakan sampel paracetamol karena paracetamol merupakan suatu senyawa yang memiliki kemampuan yang sulit menguap, paracetamol mempunyai sifat polar dengan gugus kromofor sehingga bisa larut dengan metanol. Apabila pada percobaan HPLC menggunakan sampel yang mampu menguap maka HPLC tidak dapat mendeteksi senyawa yang ada dalam sampel, karena senyawa akan menguap sebelum deteksi selesai.
       Pada percobaan ini didapatkan hasil luas puncak pada larutan standar dengan konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan 250 ppm secara berturut-turut adalah 2478966, 4229531, 6142679, 12262609, dan 9025660. Waktu retensi larutan standar dengan konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan 250 ppm secara berutut-turut adalah 2,480 ; 2,477 ;  2,490 ; 2,350 ; 2,490 menit. Hasil luas puncak pada larutan cuplikan A adalah 4003038, dengan retensi waktu 2,480 menit. 
       Konsentrasi cuplikan berdasarkan perhitungan metode regresi sebesar 150 ppm. Sedangkan berdasarkan kurva standar regresi 106 ppm. Hasil yang diperoleh dari perhitungan dan kurva tidak beda jauh. Persamaan ini sudah memenuhi parameter linieritas sehingga dengan persamaan linier ini. HPLC merupakan alat analisis kualitatif dan kuantitatif yang sangat teliti dan akurat terutama terhadap larutan cuplikan parasetamol yang tidak menguap.

       Pada setiap analisis menggunakan kromatografi memiliki kekurangan dan kelebihan, pada HPLC memiliki kekurangan dan kelebihan yaitu :
a. Kelebihan dari alat HPLC : Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis, dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi, kolom dapat digunakan kembali, waktu analisa cukup singkat, HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil, dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya, teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.   
b. Kelemahan dari alat HPLC : harga sebuah alat HPLC cukup mahal, sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor, pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

III. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
1. Prinsip kerja HPLC adalah  ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksi kedalam kolom maka          sampel tersebut akan terelusi bersama fase geraknya. Sampel yang dimasukkan kedalam kolom          tersebut kemudian akan terurai dan akan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )                sesuai perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detektor            pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat            oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan                  personal komputer ( PC ) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
2. Konsentrasi cuplikan berdasarkan perhitungan metode regresi sebesar 150 ppm. Sedangkan                berdasarkan kurva standar regresi 106 ppm

DAFTAR PUSTAKA

Cserhati, T. dan Forgancs, E. 1999. Chromatography in Food science and Technology. Technomic Publishing. Lancaster Basel.
Day, R.A., Underwood, A. L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga, Jakarta.
Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern.  PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.
Hendayana, S. 1994. Kimia Analitik Instrumen. IKIP Semarang Press, Bandung.
Nurhamida. 2005. Penentuan Kondisi Optimum HPLC Untuk Pemisahan Residu Peptisida Imidaklorid, Profenofos, dan Deltametrin Pada Cabai ( Capsicumannum ). Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian Indonesia 7(2) : 87-93
Settle, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. Prentice Hall PTR, New Jersey USA.
Wahyono, D. dan Hakim, A. 2009. Uji Ketersediaan Hayati Tablet Paracetamol dan Tablet Teofilin Pada Kelinci. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 7 (1) 19-23.